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介紹大鼠心肌細胞H9C2的試劑配制及實驗步驟

  • 發布日期:2021-12-26      瀏覽次數:62
    •   H9c2(2-1)是由B.Kimes和B.Brandt從胚胎BD1X大鼠心臟組織衍生的原始克隆細胞系的亞克隆,并且表現出骨骼肌的許多特性。該系中的成肌細胞將融合形成多核肌管并響應乙酰膽堿刺激。如果培養基中的血清濃度降至1%,則融合發生得更快。
        一、大鼠心肌細胞H9C2試劑配制:
       ?。?)PBS磷酸鹽緩沖液:PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL,調pH7.2,121℃,30min高壓滅菌,4℃冰箱保存。
       ?。?)DMEM-F12細胞生長培養液:臨用前根據需要按體積比10%加胎牛血清,最后按1%體積分數加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素),使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100U/mL和100U/mL,置于4℃冰箱保存。
        (3)心肌細胞培養基:DMEM/F12+10%胎牛血清(Hyclone)+1%雙抗+Brdu(終濃度為0.1mmol/L),0.2um一次性過濾器過濾除菌,制備100ml,現配先用。
       ?。?)0.125%胰酶消化液:將實驗室現有的0.25%胰酶消化液用蒸餾水稀釋2倍。
        二、大鼠心肌細胞H9C2實驗步驟:
       ?。?)取出生7d內新生乳大鼠,燒杯裝載放入細胞間,另準備75%酒精,先用鑷子使乳鼠頸部脫臼致死,在75%酒精中浸泡至少1min,然后固定在泡沫板上,先用碘酒消毒胸腹部,再用酒精消毒。取出無菌剪刀和鑷子,先用酒精棉球再次消毒,剪開胸,取心尖部位,快速置于含雙抗的預冷的PBS溶液潤洗3次。
       ?。?)剔除周圍結締組織,將心臟置于無菌平皿中,將心臟盡量剪碎,平皿內加入適量0.125%的胰酶,在37℃培養箱中,采用分次消化,每次消化5min,一共消化8-10次。
       ?。?)每次消化后取上清液,并加入等量的含10%的DMEM/F12培養基,輕輕混勻,中和胰酶的消化,防止消化過度。用200目細胞過濾篩子過濾含細胞的混合液,最后將過濾后的細胞懸液1000rpm離心5min。離心后收集沉淀,用PBS再次重復離心3次。用細胞培養基將細胞沉淀重懸,接種于細胞培養瓶中培養。
       ?。?)培養90min左右,將未貼壁的細胞懸液吸出。此時已經貼壁的是心肌成纖維細胞。
       ?。?)將未貼壁的細胞懸液放入新的培養瓶中繼續培養,并每日觀察心肌細胞的生長。
        
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